预制胶选择指导

• 凝胶选择指导一览表

• 10×8系列预制胶选择指导参数

10×8 Gel

目录号	% 浓度	孔数	上样体积	电泳缓冲液	转印缓冲液	蛋白分离范围
M00810C	8%	10	80 μl	MOPS，MES	Tris-Bicine	180―20 kDa
M01010C	10%	10	80 μl	MOPS，MES	Tris-Bicine	160―20 kDa
M01210C	12%	10	80 μl	MOPS，MES	Tris-Bicine	120―6.5 kDa
M42010C	4-20%	10	80 μl	MOPS，MES	Tris-Bicine	250―10 kDa
M81610C	8-16%	10	80 μl	MOPS，MES	Tris-Bicine	160―10 kDa
M41210C	4-12%	10	80 μl	MOPS，MES	Tris-Bicine	250―20 kDa
M00812C	8%	12	60 μl	MOPS，MES	Tris-Bicine	180―20 kDa
M01012C	10%	12	60 μl	MOPS，MES	Tris-Bicine	160―20 kDa
M41212C	12%	12	60 μl	MOPS，MES	Tris-Bicine	120―6.5 kDa
M42012C	4-20%	12	60 μl	MOPS，MES	Tris-Bicine	250―10 kDa
M81612C	8-16%	12	60 μl	MOPS，MES	Tris-Bicine	160―10 kDa
M01212C	4-12%	12	60 μl	MOPS，MES	Tris-Bicine	250―20 kDa
M00815C	8%	15	40 μl	MOPS，MES	Tris-Bicine	180―20 kDa
M01015C	10%	15	40 μl	MOPS，MES	Tris-Bicine	160―20 kDa
M41215C	12%	15	40 μl	MOPS，MES	Tris-Bicine	120―6.5 kDa
M42015C	4-20%	15	40 μl	MOPS，MES	Tris-Bicine	250―10 kDa
M81615C	8-16%	15	40 μl	MOPS，MES	Tris-Bicine	160―10 kDa
M01215C	4-12%	15	40 μl	MOPS，MES	Tris-Bicine	250―20 kDa

	上样量	推荐上样量	每孔总蛋白数
10×8 Gel，10-well	80 μl	5-25 μl	60 μg
10×8 Gel，12-well	60 μl	4-20 μl	50 μg
10×8 Gel，15-well	40 μl	3-15 μl	40 μg

10X MOPS缓冲液配方：

	SDS-PAGE	Native PAGE
Tris base	60.6 g	60.6 g
MOPS	104.6 g	104.6 g
SDS	10 g	--
EDTA	3 g	3 g
去离子水	To 1000 ml	To 1000 ml

10X MES缓冲液配方

	SDS-PAGE	Native PAGE
Tris base	60.6 g	60.6 g
MES	97.6 g	97.6 g
SDS	10 g	--
EDTA	3 g	3 g
去离子水	To 1000 ml	To 1000 ml
pH	7.3	7.3

5X上样缓冲液配方

	SDS-PAGE	Native PAGE
SDS	1.0 g	--
甘油	5.0 ml	5.0 ml
溴酚蓝	25 mg	25 mg
Tris base	150 mg	150 mg
β-巯基乙醇	1.0 ml	1.0 ml（if necessary）
去离子水	To 10 ml	To 10 ml
pH（use 8 M NaOH or 8 M HCl）	6.8	6.8

1X转印缓冲液配方

Tris base	3.0 g
Bicine	4.08 g
去离子水	Reconstitute with 900 ml H2O，then add 100 ml of methanol or ethanol per bag.

可兼容电泳槽：

• 六一和天能
• Hoefer Mighty Small（SE 260/SE 250）
• Bio-Rad Mini-PROTEAN^® II，3 & Tetra Cell

10x8系列预制胶使用说明书 10x8系列预制胶使用说明书

应用案例

• 应用案例
  

  图1：使用k8凯发的ExpressPlus™预制胶电泳后的蛋白用eStain^® 2.0蛋白染色系统染色。
  泳道1，15：5µl NEB蛋白标准（P7703S）
  泳道2，5，14：5µl大肠杆菌裂解液
  泳道3，8，13：5µlk8凯发PAGE-Marker蛋白标准（M00516）
  泳道4，6，7，12：5µlk8凯发PAGE-Marker Plus蛋白标准（ MM1397-500）
  泳道9，10，11：200ng，400ng和800ng BSA

  

  图2：G蛋白（k8凯发，Z02007）用ExpressPlus™预制胶电泳后，Western Blot发光检测。将简易western蛋白标准（k8凯发，MM0908）于4-20%的ExpressPlus™预制胶中电泳分离，转印到硝酸纤维素膜，然后用10%的无脂牛奶封闭过夜，最后用兔抗蛋白IgG（H&L）（山羊）抗体（Rockland，611-132-122）检测并用odyssey（LI-COR）扫描。泳道1-5的G蛋白含量分别为200ng，100ng， 50ng，10ng，5ng。泳道6-10的简易western蛋白标准的量分别为4µl，2µl，1µl，0.5µl，0.25µl。

  

  图3：12孔12% ExpressPlus™预制胶蛋白分离效果图，选用eStain^®蛋白染色系统（R-250）. （M01212C）
  泳道1，2，6，7，11，12： 6µl E.Coli 细胞裂解液
  泳道3，8：5μl NEB Protein Standard（P7703S）；
  泳道4，9：5µl GenScript PAGE-Marker Protein Standard（M00516）；
  泳道5，10：5µl Life Tech. Mark12 Unstained Standard (LC5677)；

产品详情

10×8系列预制胶产品列表

注意事项：k8凯发的ExpressPlus™ PAGE Gels适合在1x Bis-Tris buffer（pH 6.8）中电泳。为了得到更好的结果，请配套使用k8凯发的电泳缓冲液（产品编号M00138）。电泳结束后，配套使用k8凯发的电转缓冲液（产品编号M00139）来转印蛋白。另外，配置缓冲液时请参考相应的说明书。

FAQ

• 预制胶在使用前需要特别处理吗？

  ExpressPlus™预制胶产品打开包装即可用于蛋白电泳实验，但请一定撕掉胶板底部绿色封口胶带。并请检查电泳槽密封条是否需要翻转，以保证内槽密封。

• 此预制胶能否用于非变性电泳？

  可以用于非变性电泳。非变性电泳由于受蛋白质的亚基及电荷量少的影响，存在条带偏移率低（泳动速度慢）、条带不够锋利等现象。由于非变性电泳时间较长，请根据实验设计先进行电泳条件优化。

• 应该使用什么电泳缓冲液?

  推荐使用MOPS电泳缓冲液。对于小分子量蛋白，请使用MES缓冲液。请勿使用Tris甘氨酸电泳缓冲液。

• 1ХMOPS电泳缓冲液配制后是否需要调节pH值？

  k8凯发Tris-MOPS-SDS Running Buffer Powder（Cat.No：M00138）在产品设计时已经考虑了成品缓冲液pH值。配制成溶液后即可用于蛋白电泳实验，pH≈7.6。

• 跑完一块胶需要多久？

  电泳时间取决于选取的电泳缓冲液、凝胶浓度以及兴趣蛋白的分子量大小。在MOPS电泳缓冲液，140V恒压条件下，电泳时间通常是50分钟。一片凝胶电泳时，初始电流大约在70-100mA。适当提高电泳仪输出电压设定，可以缩短电泳时间。但高电压会引起电泳实验体系温度上升，导致电泳过程出现不可预料的情况。不推荐超过180V的电压设定。

• ExpressPlus™预制胶可以用于哪些电泳槽？

  只要是兼容10×8cm丙烯酰胺凝胶的垂直型电泳槽，ExpressPlus™预制胶都有良好的兼容性。

• 为什么在蛋白转印时凝胶变的很粘？

  低浓度凝胶质地较软，转膜时易受热，与转印膜粘连。

• 其他公司的出品的染料是否可以用于k8凯发预制胶染色？

  每家公司的蛋白染料产品配方不同。以考马斯亮蓝G₂₅₀或R₂₅₀为主要成分的染色液与ExpressPlus™预制胶产品兼容性较好。推荐使用k8凯发出品的eStain^®L1蛋白染色仪（Cat.No：L00657C）对电泳后凝胶进行处理。目前确认k8凯发预制胶与Thermo Fisher Scientific Inc. 的染料不兼容。天根生化科技（北京）有限公司的考马斯亮蓝快速染色液可用于ExpressPlus™预制胶产品的染色。

• 过夜脱色会影响条带的锐度吗？

  不同的脱色液配方会影响脱色效果。推荐用于过夜脱色的脱色液配方是：15%乙醇，10%乙酸的水溶液。

• ExpressPlus™预制胶在室温下稳定吗？

  ExpressPlus™预制胶在室温下可以保存1个月。为获得更佳实验效果，请2-8℃保存。

• 如何使用传统染色脱色方法处理预制胶
  • A. 考马斯亮蓝R-250使用微波炉染色：
  1. 配制染色液：在40%乙醇和10%醋酸溶液中溶解终浓度为0.1%（W/V）的考马斯亮蓝R-250。
  2. 配制脱色液：将终浓度为10%（V/V）乙醇、7.5%（V/V）醋酸溶解在一起。
  3. 电泳完成后，撬开胶板取出凝胶，然后放入装有100ml染色液的染色容器中。
  4. 盖上容器盖子并放入微波炉中用高热档位加热8分钟。为了避免危险，请注意不要让溶液沸腾。
  5. 从微波炉中取出染色容器，放在脱色摇床上常温轻摇5分钟。
  6. 倒掉染色液并用去离子水小心清洗凝胶。
  7. 倒掉去离子水，并加入100ml脱色液。
  8. 盖上盖子，放入微波炉中用高热档位加热8分钟。
  9. 倒掉脱色液，加入新的脱色液，重复步骤8。
  10. 从微波炉中取出，放在脱色摇床上常温轻轻震荡至背景清晰。
  • B. 考马斯亮蓝R-250常规染色：
  1. 配制染色液：在40%乙醇和10%醋酸溶液中溶解终浓度为0.1%（W/V）的考马斯亮蓝R-250。
  2. 配制脱色液：将终浓度为10%（V/V）乙醇、7.5%（V/V）醋酸溶解在一起。
  3. 电泳完成后，撬开胶板取出凝胶，然后放入装有100ml染色液的染色容器中。
  4. 放于摇床上轻摇1小时。
  5. 倒掉染色液并用去离子水小心清洗凝胶。
  6. 倒掉去离子水，并加入100ml脱色液。
  7. 放于摇床上轻摇1小时。
  8. 更换新鲜脱色液，继续放于摇床上脱色1小时。
  9. 重复步骤7、8一次。
  10. 更换新鲜脱色液，放于摇床上过夜脱色至次日背景清晰。
• 疑难解答

  问题	可能原因	解决方法
  条带变形	上样孔中有气泡或者有凝胶保存缓冲液。	加注电泳缓冲液前后，使用注射器吸取缓冲液轻轻冲洗上样孔，将气泡吹出。
  	样品蛋白浓度过高。	使用上样缓冲液稀释蛋白样品。
  条带拖曳、滞孔	样品中含有较大颗粒杂质如细胞碎片、菌体碎片。	高速离心后，取上清液电泳。
  	蛋白样品（如包涵体蛋白） 未充分溶解。	在样品中添加额外的十二烷基硫酸钠硫酸钠（SDS）或者使用上样缓冲液稀释样品。
  高浓度条带出现在相邻泳道	上样时，样品溢出到相邻条带。	降低上样量。发现溢出时使用缓冲液冲洗上样孔。
  	上样孔破损。	移除制孔梳时加倍小心。发现上样孔破损后换用新的凝胶。
  	胶板变形。	在安装预制胶时先移除制孔梳，再固定在电泳槽内。
  		使用垫片、翻转密封条时注意是否会对凝胶产生过大的压力，导致凝胶变形。
  	凝胶变干，上样孔萎缩。	打开包装后，防止凝胶干燥。
  		为防止凝胶变干，可以尽快装置到电泳槽内，并加注电泳缓冲液。
  		怀疑凝胶变干时，可将凝胶在电泳缓冲液中浸泡一段时间，待凝胶恢复形状后上样。
  泳道整体成外“八”字形	胶板变形。	安装预制胶时先移除制孔梳，再固定在电泳槽内。
  		使用垫片、翻转密封条时注意是否会对凝胶产生过大的压力，导致凝胶变形。
  条带迁移速度过慢	凝胶底部绿色胶带未移除。	移除绿色密封胶带。
  	凝胶安装不当，电泳槽内槽漏液（与外槽有溶液联通现象）。	检查内槽密封条、垫片等附件是否安装恰当。
  		确认凝胶安装位置，重新安装凝胶。
  	电压设置有误，或者使用了不当的电泳缓冲液。	推荐使用140V恒压条件电泳。
  		推荐使用正确浓度的MOPS电泳缓冲液
  蛋白条带前沿模糊	离子干扰（小分子蛋白电泳容易出现此现象）。	换用MES电泳缓冲液。
  蛋白条带前沿变黄	电泳缓冲液性能下降，pH降低。	换用新鲜配制的电泳缓冲液。
  蛋白分离效果不佳	凝胶浓度选择不当。	根据凝胶更佳分离范围选用不同浓度凝胶。 对于小分子蛋白的分离，请选用较高分离胶浓度的预制胶产品或者换用专门为小蛋白开发的预制胶产品。
  	样品蛋白量超出凝胶分离能力。	降低上样量，将总蛋白量控制在60μg以内
  	样品含盐量过高。	使用透析、超滤，或者稀释的方法降低盐浓度后电泳。
  	电泳体系温度过高。	提高电泳缓冲液用量。
  		或者使用冰袋对缓冲液降温降温、在低温环境中进行电泳实验等方法改善效果。
  	MOPS电泳缓冲液性能无法达到实验设计要求。	换用MES电泳缓冲液进行尝试。
  8%的胶在转膜时粘在膜上	凝胶浓度低、质地较软，转膜时易受热，与转印膜粘连。	添加冰袋、或在低温环境中进行实验，控制转膜温度。
  非变性电泳时条带模糊	非变性电泳由于受蛋白质的亚基及电荷量少的影响，存在涌动速度慢、条带不够锋利等现象。	优化电泳缓冲液配方。
  		保证蛋白带有足够的电荷量。
  		同时注意是否需要调整电泳仪电源正负极。